Qu'est-ce que la loi de Beer-Lambert ?
La loi de Beer-Lambert (parfois appelée loi de Beer) relie l'absorbance de la lumière par une solution aux propriétés de cette dernière. Elle énonce que l'absorbance est directement proportionnelle au coefficient d'absorption molaire de l'espèce absorbante, à la concentration de la solution et à la longueur du trajet optique parcouru par la lumière à travers l'échantillon. Ce calculateur résout \(A = \varepsilon \cdot c \cdot l\) instantanément et indique également la transmittance qui en résulte.
Comment utiliser ce calculateur
Saisissez trois valeurs : le coefficient d'absorption molaire \(\varepsilon\) (en L·mol⁻¹·cm⁻¹, une constante propre à une substance donnée pour une longueur d'onde donnée), la concentration \(c\) en mol/L et la longueur du trajet optique \(l\) en cm (généralement 1 cm pour une cuve standard). Le calculateur multiplie ces grandeurs pour obtenir l'absorbance, une valeur sans dimension (UA), puis la convertit en transmittance.
La formule expliquée
Dans l'équation \(A = \varepsilon c l\), A désigne l'absorbance (sans dimension), \(\varepsilon\) le coefficient d'absorption molaire (L·mol⁻¹·cm⁻¹), c la concentration molaire (mol/L) et l la longueur du trajet optique (cm). Les unités s'annulent pour ne laisser qu'un nombre pur. La transmittance se déduit de \(T = 10^{-A}\), et le pourcentage de transmittance vaut \(\%T = 100 \times 10^{-A}\). Plus l'absorbance est élevée, moins la lumière traverse l'échantillon.
Exemple résolu
Supposons qu'un colorant présente \(\varepsilon = 20\,000\) L·mol⁻¹·cm⁻¹, une concentration de 0,0001 mol/L (\(1 \times 10^{-4}\) M), mesurée dans une cuve de 1 cm. On obtient alors $$A = 20\,000 \times 0{,}0001 \times 1 = 2{,}0.$$ La transmittance vaut \(T = 10^{-2} = 0{,}01\), soit 1 % — autrement dit, seulement 1 % de la lumière traverse l'échantillon.
Valeurs typiques d'absorptivité molaire
L'absorptivité molaire (également appelée coefficient d'extinction molaire, \(\varepsilon\)) est une propriété intrinsèque d'une substance à une longueur d'onde donnée, exprimée en L·mol⁻¹·cm⁻¹. Comme \(\varepsilon\) varie fortement avec la longueur d'onde, chaque valeur ci-dessous est rapportée à la longueur d'onde analytique (pic) où elle est normalement mesurée. Utilisez la valeur pour le tampon exact et la longueur d'onde de votre propre dosage si possible, car \(\varepsilon\) peut varier avec le solvant, le pH et la température.
| Espèce / colorant | Longueur d'onde (nm) | \(\varepsilon\) (L·mol⁻¹·cm⁻¹) |
|---|---|---|
| NADH (réduit) | 340 | 6 220 |
| NAD⁺ / NADH | 260 | ~18 000 |
| Permanganate de potassium (KMnO₄) | 525 | ~2 400 |
| Bleu de méthylène | 665 | ~95 000 |
| Chlorophylle a (dans l'éther diéthylique) | 662 | ~90 000 |
| Chlorophylle b (dans l'éther diéthylique) | 644 | ~56 000 |
| Bleu de bromophénol (forme basique) | 590 | ~70 000 |
| Cytochrome c (réduit) | 550 | ~27 700 |
| FAD (oxydé) | 450 | ~11 300 |
| ADN double brin (par nucléotide) | 260 | ~6 600 |
Les valeurs sont des chiffres représentatifs de la littérature et dépendent du solvant et des conditions ; vérifiez-les par rapport à vos propres étalons pour les travaux quantitatifs. Pour les travaux de pureté des protéines, le rapport A260/A280 connexe utilise ces absorbances UV directement plutôt que \(\varepsilon\).
Interprétation de votre absorbance et transmittance
L'absorbance \(A\) et la transmittance \(T\) décrivent la même mesure sur des échelles différentes, liées par \(A = -\log_{10}(T)\) où \(T\) est la fraction de lumière transmise (\(\%T = 100 \times T\)). L'absorbance est logarithmique, donc chaque augmentation d'une unité signifie dix fois moins de lumière atteint le détecteur.
- A ≈ 0 — l'échantillon est essentiellement transparent à cette longueur d'onde et transmet environ 0 unité d'absorbance (≈100 %T). Peu ou pas d'analyte détecté.
- A = 1 — seulement 10 %T ; 90% de la lumière est absorbée.
- A = 2 — seulement 1 %T ; 99% de la lumière est absorbée. Le détecteur reçoit maintenant très peu de signal.
La plupart des spectrophotomètres donnent leurs lectures les plus précises et linéaires dans la plage d'environ A = 0,1 à 1,0. En dessous d'environ 0,1, le signal est petit par rapport au bruit de base ; au-dessus d'environ 1,0, la lumière parasite et les limitations du détecteur causent une déviation de la relation de Beer-Lambert par rapport à la linéarité, donc la concentration apparente se lit bas.
Si votre lecture dépasse environ 1,0, diluez l'échantillon (par exemple 1:2 ou 1:10), remesura, et multipliez le résultat par le facteur de dilution. Cela maintient la mesure dans la région linéaire où \(A = \varepsilon c l\) se maintient de manière fiable. Vous pouvez planifier une telle dilution avec une calculatrice de dilution de solution C1V1 = C2V2.
Absorbance selon les différentes entrées
Le tableau ci-dessous fixe l'absorptivité molaire à \(\varepsilon = 10{,}000\) L·mol⁻¹·cm⁻¹ et varie la concentration \(c\) et la longueur du trajet \(l\). L'absorbance évolue linéairement avec les deux, tandis que la transmittance suit \(\%T = 100 \times 10^{-A}\). Remarquez comment une concentration plus élevée ou une cuvette plus longue pousse \(A\) au-delà de la fenêtre fiable 0,1–1,0.
| \(\varepsilon\) (L·mol⁻¹·cm⁻¹) | \(c\) (M) | \(l\) (cm) | \(A = \varepsilon c l\) | %T |
|---|---|---|---|---|
| 10 000 | 1×10⁻⁵ | 1 | 0,10 | 79,4% |
| 10 000 | 5×10⁻⁵ | 1 | 0,50 | 31,6% |
| 10 000 | 1×10⁻⁴ | 1 | 1,00 | 10,0% |
| 10 000 | 1×10⁻⁴ | 0,5 | 0,50 | 31,6% |
| 10 000 | 1×10⁻⁴ | 2 | 2,00 | 1,0% |
Les deux dernières lignes comparent les longueurs de trajet pour la même solution : réduire de moitié la cuvette à 0,5 cm réduit de moitié \(A\) dans la plage idéale, tandis qu'une cellule de 2 cm le double à 2,00 — en dehors de la région linéaire, où la dilution serait la meilleure correction. Pour trouver la concentration qui a produit une absorbance mesurée, inversez le calcul avec une calculatrice de concentration à partir de l'absorbance (loi de Beer-Lambert).
FAQ
Quelle est la longueur de trajet habituelle ? Les cuves standard de spectrophotomètre ont un trajet optique de 1 cm, si bien que la loi se simplifie souvent en \(A = \varepsilon c\).
Pourquoi la loi n'est-elle plus valable à forte concentration ? À forte concentration, les molécules interagissent entre elles, et la lumière parasite ou les limites de l'instrument provoquent des écarts à la linéarité. La loi de Beer est donc la plus fiable pour les solutions diluées (en général A < 1).
Puis-je calculer la concentration à la place ? Oui — réorganisez la formule sous la forme \(c = A / (\varepsilon l)\). Si vous connaissez l'absorbance et les constantes, il suffit de diviser en conséquence.
