¿Qué es la ley de Beer-Lambert?
La ley de Beer-Lambert (también conocida como ley de Beer) relaciona la absorbancia de la luz por parte de una disolución con las propiedades de dicha disolución. Establece que la absorbancia es directamente proporcional a la absortividad molar de la especie absorbente, a la concentración de la disolución y a la longitud del camino óptico que recorre la luz a través de la muestra. Esta calculadora resuelve \(A = \varepsilon \cdot c \cdot l\) al instante y también te indica la transmitancia resultante.
Cómo usar esta calculadora
Introduce tres valores: la absortividad molar ε (en L·mol⁻¹·cm⁻¹, una constante propia de cada sustancia a una longitud de onda determinada), la concentración c en mol/L y el paso óptico l en cm (por lo general 1 cm en una cubeta estándar). La calculadora los multiplica para obtener el valor de absorbancia adimensional (UA) y lo convierte en transmitancia.
La fórmula al detalle
En la ecuación \(A = \varepsilon c l\), \(A\) es la absorbancia (sin dimensiones), \(\varepsilon\) es la absortividad molar (L·mol⁻¹·cm⁻¹), \(c\) es la concentración molar (mol/L) y \(l\) es el paso óptico (cm). Las unidades se cancelan y queda un número puro. La transmitancia se deduce de \(T = 10^{-A}\), y el porcentaje de transmitancia es \(\%T = 100 \times 10^{-A}\). Cuanto mayor es la absorbancia, menos luz atraviesa la muestra.
Ejemplo resuelto
Imagina que un colorante tiene \(\varepsilon = 20.000\) L·mol⁻¹·cm⁻¹, una concentración de 0,0001 mol/L (\(1 \times 10^{-4}\) M) y se mide en una cubeta de 1 cm. Entonces $$A = 20.000 \times 0{,}0001 \times 1 = 2{,}0.$$ La transmitancia es \(T = 10^{-2} = 0{,}01\), es decir, un 1 %, lo que significa que solo el 1 % de la luz consigue atravesar la muestra.
Valores típicos de absortividad molar
La absortividad molar (también llamada coeficiente de extinción molar, \(\varepsilon\)) es una propiedad intrínseca de una sustancia a una longitud de onda determinada, expresada en L·mol⁻¹·cm⁻¹. Dado que \(\varepsilon\) varía fuertemente con la longitud de onda, cada valor a continuación se reporta en la longitud de onda analítica (de pico) donde se mide normalmente. Utilice el valor para el amortiguador y la longitud de onda exactos de su propio ensayo cuando sea posible, ya que \(\varepsilon\) puede cambiar con el disolvente, el pH y la temperatura.
| Especie / colorante | Longitud de onda (nm) | \(\varepsilon\) (L·mol⁻¹·cm⁻¹) |
|---|---|---|
| NADH (reducido) | 340 | 6,220 |
| NAD⁺ / NADH | 260 | ~18,000 |
| Permanganato de potasio (KMnO₄) | 525 | ~2,400 |
| Azul de metileno | 665 | ~95,000 |
| Clorofila a (en éter dietílico) | 662 | ~90,000 |
| Clorofila b (en éter dietílico) | 644 | ~56,000 |
| Azul de bromofenol (forma básica) | 590 | ~70,000 |
| Citocromo c (reducido) | 550 | ~27,700 |
| FAD (oxidado) | 450 | ~11,300 |
| ADN de doble cadena (por nucleótido) | 260 | ~6,600 |
Los valores son cifras representativas de la literatura y dependen del disolvente y las condiciones; verifique contra sus propios estándares para trabajos cuantitativos. Para trabajos de pureza de proteínas, la relación A260/A280 relacionada utiliza estas absorbancias UV directamente en lugar de \(\varepsilon\).
Interpretación de su absorbancia y transmitancia
La absorbancia \(A\) y la transmitancia \(T\) describen la misma medida en diferentes escalas, relacionadas por \(A = -\log_{10}(T)\) donde \(T\) es la fracción de luz transmitida (\(\%T = 100 \times T\)). La absorbancia es logarítmica, por lo que cada aumento de unidad significa diez veces menos luz llega al detector.
- A ≈ 0 — la muestra es esencialmente transparente en esta longitud de onda y transmite aproximadamente 0 unidades de absorbancia (≈100 %T). Se detecta poco o ningún analito.
- A = 1 — solo 10 %T; 90% de la luz se absorbe.
- A = 2 — solo 1 %T; 99% de la luz se absorbe. El detector ahora ve muy poca señal.
La mayoría de los espectrofotómetros dan sus lecturas más precisas y lineales en el rango de aproximadamente A = 0.1 a 1.0. Por debajo de aproximadamente 0.1, la señal es pequeña en relación con el ruido de línea base; por encima de aproximadamente 1.0, la luz dispersa y las limitaciones del detector hacen que la relación de Beer-Lambert se desvíe de la linealidad, por lo que la concentración aparente se lee baja.
Si su lectura supera aproximadamente 1.0, diluya la muestra (por ejemplo 1:2 o 1:10), vuelva a medir y multiplique el resultado por el factor de dilución. Esto mantiene la medida dentro de la región lineal donde \(A = \varepsilon c l\) se cumple confiablemente. Puede planificar tal dilución con una calculadora de dilución de soluciones C1V1 = C2V2.
Absorbancia en diferentes entradas
La tabla a continuación fija la absortividad molar en \(\varepsilon = 10{,}000\) L·mol⁻¹·cm⁻¹ y varía la concentración \(c\) y la longitud del camino \(l\). La absorbancia escala linealmente con ambas, mientras que la transmitancia sigue \(\%T = 100 \times 10^{-A}\). Observe cómo una concentración más alta o una cubeta más larga empuja \(A\) fuera de la ventana confiable de 0.1–1.0.
| \(\varepsilon\) (L·mol⁻¹·cm⁻¹) | \(c\) (M) | \(l\) (cm) | \(A = \varepsilon c l\) | %T |
|---|---|---|---|---|
| 10,000 | 1×10⁻⁵ | 1 | 0.10 | 79.4% |
| 10,000 | 5×10⁻⁵ | 1 | 0.50 | 31.6% |
| 10,000 | 1×10⁻⁴ | 1 | 1.00 | 10.0% |
| 10,000 | 1×10⁻⁴ | 0.5 | 0.50 | 31.6% |
| 10,000 | 1×10⁻⁴ | 2 | 2.00 | 1.0% |
Las dos últimas filas comparan longitudes de camino para la misma solución: reducir a la mitad la cubeta a 0.5 cm reduce \(A\) al rango ideal, mientras que una celda de 2 cm lo duplica a 2.00 — fuera de la región lineal, donde la dilución sería la mejor solución. Para encontrar la concentración que produjo una absorbancia medida, invierta el cálculo con una calculadora de concentración a partir de absorbancia (Ley de Beer-Lambert).
Preguntas frecuentes
¿Cuál es un paso óptico habitual? Las cubetas estándar de los espectrofotómetros tienen un paso óptico de 1 cm, por lo que la ley a menudo se simplifica a \(A = \varepsilon c\).
¿Por qué deja de cumplirse a concentraciones altas? A concentraciones elevadas las moléculas interaccionan entre sí y, junto con la luz dispersa o las limitaciones del instrumento, aparecen desviaciones de la linealidad. Por eso la ley de Beer es más precisa con disoluciones diluidas (normalmente \(A < 1\)).
¿Puedo calcular la concentración en su lugar? Sí. Basta con despejar: \(c = A / (\varepsilon l)\). Si conoces la absorbancia y las constantes, solo tienes que dividir.
