Что такое закон Бугера–Ламберта–Бера?
Закон Бугера–Ламберта–Бера (в зарубежной литературе — закон Бера, Beer's law) связывает поглощение света раствором со свойствами самого раствора. Согласно ему, оптическая плотность прямо пропорциональна молярному коэффициенту поглощения вещества, концентрации раствора и длине оптического пути, который свет проходит через образец. Этот калькулятор мгновенно решает уравнение \(A = \varepsilon \cdot c \cdot l\) и заодно показывает соответствующее пропускание.
Как пользоваться калькулятором
Введите три значения: молярный коэффициент поглощения \(\varepsilon\) (в Л·моль⁻¹·см⁻¹ — постоянная величина для конкретного вещества на заданной длине волны), концентрацию \(c\) в моль/л и толщину слоя \(l\) в см (обычно 1 см для стандартной кюветы). Калькулятор перемножает их, выдаёт безразмерное значение оптической плотности (AU) и переводит его в пропускание.
Разбор формулы
В уравнении \(A = \varepsilon c l\) величина \(A\) — это оптическая плотность (безразмерная), \(\varepsilon\) — молярный коэффициент поглощения (Л·моль⁻¹·см⁻¹), \(c\) — молярная концентрация (моль/л), а \(l\) — толщина слоя (см). Единицы измерения сокращаются, и в результате остаётся чистое число. Пропускание вычисляется по формуле \(T = 10^{-A}\), а в процентах — \(\%T = 100 \times 10^{-A}\). Чем выше оптическая плотность, тем меньше света проходит сквозь образец.
Пример расчёта
Допустим, краситель имеет \(\varepsilon = 20\,000\) Л·моль⁻¹·см⁻¹, концентрацию 0,0001 моль/л (\(1 \times 10^{-4}\) М) и измеряется в кювете толщиной 1 см. Тогда $$A = 20\,000 \times 0{,}0001 \times 1 = 2{,}0.$$ Пропускание составит \(T = 10^{-2} = 0{,}01\), то есть 1 % — значит, через образец проходит лишь 1 % света.
Частые вопросы
Какова типичная толщина слоя? Стандартные кюветы спектрофотометра имеют толщину 1 см, поэтому закон нередко упрощается до \(A = \varepsilon c\).
Почему закон перестаёт работать при высокой концентрации? При высоких концентрациях молекулы начинают взаимодействовать между собой, а рассеянный свет и ограничения прибора приводят к отклонениям от линейности. Поэтому закон Бера наиболее точен для разбавленных растворов (как правило, при \(A < 1\)).
Можно ли найти концентрацию? Да — преобразуйте формулу к виду \(c = A / (\varepsilon l)\). Зная оптическую плотность и постоянные, просто выполните деление.
Типичные значения молярной поглощаемости
Молярная поглощаемость (также называемая коэффициентом молярного поглощения, \(\varepsilon\)) — это внутреннее свойство вещества при данной длине волны, выражаемое в л·моль⁻¹·см⁻¹. Поскольку \(\varepsilon\) сильно зависит от длины волны, каждое значение ниже приведено на аналитической (пиковой) длине волны, при которой оно обычно измеряется. По возможности используйте значение для точного буфера и длины волны вашего собственного анализа, так как \(\varepsilon\) может изменяться в зависимости от растворителя, pH и температуры.
| Вид / краситель | Длина волны (нм) | \(\varepsilon\) (л·моль⁻¹·см⁻¹) |
|---|---|---|
| NADH (восстановленный) | 340 | 6 220 |
| NAD⁺ / NADH | 260 | ~18 000 |
| Перманганат калия (KMnO₄) | 525 | ~2 400 |
| Метиленовый синий | 665 | ~95 000 |
| Хлорофилл a (в диэтиловом эфире) | 662 | ~90 000 |
| Хлорофилл b (в диэтиловом эфире) | 644 | ~56 000 |
| Бромфеноловый синий (основная форма) | 590 | ~70 000 |
| Цитохром c (восстановленный) | 550 | ~27 700 |
| FAD (окисленный) | 450 | ~11 300 |
| Двухцепочечная ДНК (на нуклеотид) | 260 | ~6 600 |
Значения — это репрезентативные данные литературы и зависят от растворителя и условий; проверьте по собственным стандартам для количественной работы. Для работ по определению чистоты белков связанное отношение A260/A280 использует эти УФ-поглощения напрямую вместо \(\varepsilon\).
Интерпретация вашего поглощения и пропускания
Поглощение \(A\) и пропускание \(T\) описывают одно и то же измерение в различных шкалах, связанные соотношением \(A = -\log_{10}(T)\), где \(T\) — доля пропущенного света (\(\%T = 100 \times T\)). Поглощение логарифмическое, поэтому каждое увеличение на единицу означает, что до детектора доходит в десять раз меньше света.
- A ≈ 0 — образец практически прозрачен при этой длине волны и пропускает около 0 единиц поглощения (≈100 %T). Аналит почти не обнаруживается.
- A = 1 — только 10 %T; 90% света поглощается.
- A = 2 — только 1 %T; 99% света поглощается. Детектор теперь видит очень слабый сигнал.
Большинство спектрофотометров дают наиболее точные линейные показания в диапазоне примерно A = 0,1–1,0. Ниже примерно 0,1 сигнал мал относительно шума фона; выше примерно 1,0 рассеянный свет и ограничения детектора вызывают отклонение закона Бера–Ламберта от линейности, поэтому видимая концентрация читается ниже.
Если ваше показание превышает примерно 1,0, разбавьте образец (например, 1:2 или 1:10), повторно измерьте и умножьте результат на коэффициент разбавления. Это держит измерение в линейной области, где \(A = \varepsilon c l\) надежно выполняется. Вы можете спланировать такое разбавление с помощью калькулятора разбавления раствора C1V1 = C2V2.
Поглощение при различных входных значениях
В таблице ниже молярная поглощаемость зафиксирована на \(\varepsilon = 10{,}000\) л·моль⁻¹·см⁻¹ и изменяется концентрация \(c\) и длина пути \(l\). Поглощение масштабируется линейно с обоими, в то время как пропускание следует \(\%T = 100 \times 10^{-A}\). Обратите внимание, что более высокая концентрация или более длинная кювета толкает \(A\) выше надежного окна 0,1–1,0.
| \(\varepsilon\) (л·моль⁻¹·см⁻¹) | \(c\) (М) | \(l\) (см) | \(A = \varepsilon c l\) | %T |
|---|---|---|---|---|
| 10 000 | 1×10⁻⁵ | 1 | 0,10 | 79,4% |
| 10 000 | 5×10⁻⁵ | 1 | 0,50 | 31,6% |
| 10 000 | 1×10⁻⁴ | 1 | 1,00 | 10,0% |
| 10 000 | 1×10⁻⁴ | 0,5 | 0,50 | 31,6% |
| 10 000 | 1×10⁻⁴ | 2 | 2,00 | 1,0% |
Последние два ряда сравнивают длины пути для одного и того же раствора: сокращение кюветы до 0,5 см сокращает \(A\) до идеального диапазона, в то время как 2 см ячейка удваивает его до 2,00 — вне линейной области, где разбавление было бы лучшим решением. Чтобы найти концентрацию, которая произвела измеренное поглощение, выполните обратный расчет с помощью калькулятора концентрации из поглощения (закон Бера–Ламберта).
