Qu'est-ce que le rapport A260/A280 ?
Le rapport A260/A280 est une mesure spectrophotométrique rapide de la pureté des acides nucléiques. Les acides nucléiques absorbent fortement la lumière ultraviolette à 260 nm, tandis que les protéines absorbent à 280 nm, en raison de la présence d'acides aminés aromatiques comme le tryptophane et la tyrosine. En divisant l'absorbance mesurée à 260 nm par celle mesurée à 280 nm, on obtient un rapport qui révèle la quantité de protéines ou d'autres contaminants présents dans une préparation d'ADN ou d'ARN.
Comment utiliser ce calculateur
Analysez votre échantillon sur un spectrophotomètre UV (par exemple un NanoDrop) et relevez les valeurs d'absorbance à 260 nm et à 280 nm. Saisissez les deux valeurs ci-dessus : le calculateur affiche instantanément le rapport. Pour des mesures fiables, veillez à utiliser un échantillon correctement dilué et un blanc de référence adapté.
La formule expliquée
Le calcul se résume à $$\text{Rapport} = \dfrac{A_{260}}{A_{280}}$$ Comme il s'agit du rapport de deux absorbances mesurées sur le même échantillon, la longueur du trajet optique et la concentration s'annulent en grande partie. C'est ce qui fait du rapport un indicateur de qualité robuste, indépendant du degré de concentration de l'échantillon.
Comment interpréter le résultat
Un rapport d'environ 1,8 est généralement considéré comme le signe d'un ADN « pur », et un rapport proche de 2,0 pour l'ARN. Un rapport nettement plus faible (par exemple inférieur à 1,7) peut signaler la présence de protéines, de phénol ou d'autres contaminants qui absorbent autour de 280 nm. À l'inverse, un rapport plus élevé que prévu peut traduire une contamination de l'échantillon d'ADN par de l'ARN.
Exemple concret
Imaginons qu'un NanoDrop affiche \(A_{260} = 1{,}8\) et \(A_{280} = 1{,}0\). Le rapport est alors de $$\frac{1{,}8}{1{,}0} = 1{,}8$$ ce qui indique un ADN génomique propre, avec très peu de contamination protéique.
Valeurs de référence de pureté A260/A280
Le rapport A260/A280 compare l'absorbance à 260 nm (le maximum d'absorption des acides nucléiques) avec l'absorbance à 280 nm (le maximum d'absorption des acides aminés aromatiques dans les protéines). Parce que l'ADN et l'ARN purifiés ont des rapports caractéristiques, la valeur est une vérification spectrophotométrique rapide de la propreté d'un échantillon. Le rapport complémentaire A260/A230 détecte une classe différente de contaminants (composés organiques et sels chaotropes), donc les deux sont généralement rapportés ensemble.
| Échantillon / condition | A260/A280 attendu | A260/A230 attendu | Interprétation |
|---|---|---|---|
| ADN double brin pur (ADNds) | ~1,8 | ~2,0–2,2 | Cible acceptée pour l'ADN génomique/plasmidique propre |
| ARN pur | ~2,0 | ~2,0–2,2 | Cible acceptée pour l'ARN total/messager propre |
| ADN simple brin pur (ADNss) / oligonucléotides | ~1,9 | ~2,0–2,2 | Tombe entre l'ADNds et l'ARN selon la composition en bases |
| A260/A280 inférieur à ~1,7 | < 1,7 | — | Protéine, phénol ou autres absorbants à 280 nm probablement présents |
| A260/A280 supérieur à ~2,0 (pour l'ADN) | > 2,0 | — | Possible contamination par ARN, nucléotides dégradés ou pH alcalin |
| A260/A230 faible (par ex. < 1,8) | — | < 1,8 | Contamination par sels de guanidine, phénol, EDTA ou glucides |
Contaminants courants et leurs effets
- Protéine — absorbe fortement à 280 nm (tryptophane, tyrosine, phénylalanine), abaissant le rapport A260/A280 en dessous de 1,8.
- Phénol — un résidu de l'extraction phénol-chloroforme ; il absorbe près de 270–280 nm et aussi à 230 nm, déprimant les deux rapports et gonflant le rendement apparent.
- Sels de guanidine / chaotropes et EDTA — absorbent autour de 230 nm, abaissant principalement le rapport A260/A230 tout en laissant A260/A280 plus proche de la normale.
- ARN dans une préparation d'ADN — pousse le rapport A260/A280 vers le haut (vers 2,0) car l'ARN lit plus haut que l'ADN à ce rapport.
Exemple travaillé : un spectrophotomètre rapporte A260 = 0,452 et A280 = 0,251. Le rapport de pureté est 1,80, indiquant un ADN double brin propre. Notez que le rapport n'a de sens que lorsque les lectures sont effectuées à pH ~7,5–8,5 avec un blanc de tampon approprié, car les conditions acides peuvent abaisser artificiellement la valeur de ~0,2–0,3.
FAQ
Quel rapport correspond à un ADN pur ? Une valeur proche de 1,8 indique un ADN double brin pur.
Et pour l'ARN ? Un ARN pur présente généralement un rapport d'environ 2,0.
Faut-il aussi vérifier le rapport A260/A230 ? Oui. Le rapport A260/A230 (idéalement compris entre 2,0 et 2,2) permet de détecter les contaminants organiques tels que la guanidine ou le phénol, que le rapport A260/A280 peut ne pas révéler.
