A260/A280 अनुपात क्या है?
A260/A280 अनुपात न्यूक्लिक एसिड की शुद्धता मापने का एक तेज़ स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक तरीका है। न्यूक्लिक एसिड 260 nm पर पराबैंगनी (UV) प्रकाश को मज़बूती से अवशोषित करते हैं, जबकि प्रोटीन — ट्रिप्टोफैन और टायरोसीन जैसे एरोमैटिक अमीनो एसिड के कारण — 280 nm पर अवशोषित होते हैं। 260 nm के अवशोषण को 280 nm के अवशोषण से भाग देने पर जो अनुपात मिलता है, वह बताता है कि आपके DNA या RNA नमूने में कितना प्रोटीन या अन्य संदूषक मौजूद है।
इस कैलकुलेटर का उपयोग कैसे करें
अपने नमूने को किसी UV स्पेक्ट्रोफोटोमीटर (जैसे NanoDrop) पर पढ़ें और 260 nm तथा 280 nm पर अवशोषण मान नोट करें। ऊपर दोनों संख्याएँ दर्ज करें और कैलकुलेटर तुरंत अनुपात दिखा देगा। सटीक रीडिंग के लिए हमेशा ब्लैंक किया हुआ और ठीक से पतला (dilute) किया गया नमूना इस्तेमाल करें।
फॉर्मूला समझें
गणना बेहद सरल है:
$$\text{Ratio} = \dfrac{A_{260}}{A_{280}}$$चूँकि यह एक ही नमूने पर मापे गए दो अवशोषण मानों का अनुपात है, इसलिए पाथ लेंथ और सांद्रता काफ़ी हद तक एक-दूसरे को रद्द कर देते हैं। इसी वजह से यह गुणवत्ता का एक भरोसेमंद संकेतक बन जाता है, चाहे नमूना कितना भी गाढ़ा क्यों न हो।
परिणाम का अर्थ कैसे समझें
आमतौर पर DNA के लिए लगभग 1.8 और RNA के लिए लगभग 2.0 का अनुपात "शुद्ध" माना जाता है। यदि अनुपात इससे काफ़ी कम है (जैसे 1.7 से नीचे), तो इसका मतलब हो सकता है कि नमूने में प्रोटीन, फीनॉल या 280 nm के आसपास अवशोषित होने वाले अन्य संदूषक मौजूद हैं। उम्मीद से ज़्यादा अनुपात तब दिख सकता है जब DNA नमूने में RNA का संदूषण हो।
हल किया हुआ उदाहरण
मान लीजिए कि NanoDrop \(A_{260} = 1.8\) और \(A_{280} = 1.0\) बताता है। तो अनुपात होगा
$$\text{Ratio} = \dfrac{1.8}{1.0} = 1.8$$जो साफ़ जीनोमिक DNA की ओर इशारा करता है जिसमें प्रोटीन का संदूषण बहुत कम है।
A260/A280 शुद्धता संदर्भ मान
A260/A280 अनुपात 260 nm (न्यूक्लिक अम्लों का अवशोषण अधिकतम) पर अवशोषणता की तुलना 280 nm (प्रोटीन में सुगंधित अमीनो अम्लों का अवशोषण अधिकतम) पर अवशोषणता के साथ करता है। क्योंकि शुद्ध DNA और RNA की विशेषता अनुपात होते हैं, यह मान यह जांचने का एक तेज स्पेक्ट्रोफोटोमेट्रिक तरीका है कि नमूना कितना स्वच्छ है। पूरक A260/A230 अनुपात प्रदूषकों की एक अलग श्रेणी (जैविक यौगिक और अराजक लवण) का पता लगाता है, इसलिए दोनों को आमतौर पर एक साथ रिपोर्ट किया जाता है।
| नमूना / स्थिति | अपेक्षित A260/A280 | अपेक्षित A260/A230 | व्याख्या |
|---|---|---|---|
| शुद्ध द्वि-श्रृंखला DNA (dsDNA) | ~1.8 | ~2.0–2.2 | स्वच्छ जीनोमिक/प्लास्मिड DNA के लिए स्वीकृत लक्ष्य |
| शुद्ध RNA | ~2.0 | ~2.0–2.2 | स्वच्छ कुल/दूत RNA के लिए स्वीकृत लक्ष्य |
| शुद्ध एकल-श्रृंखला DNA (ssDNA) / ऑलिगोन्यूक्लिओटाइड्स | ~1.9 | ~2.0–2.2 | आधार संरचना के आधार पर dsDNA और RNA के बीच गिरता है |
| A260/A280 ~1.7 से कम | < 1.7 | — | संभवतः प्रोटीन, फेनोल, या अन्य 280 nm अवशोषक मौजूद हैं |
| A260/A280 ~2.0 से ऊपर (DNA के लिए) | > 2.0 | — | संभावित RNA ले-जाना, क्षीण न्यूक्लिओटाइड्स, या क्षारीय pH |
| कम A260/A230 (जैसे < 1.8) | — | < 1.8 | गुआनिडीन लवण, फेनोल, EDTA, या कार्बोहाइड्रेट प्रदूषण |
सामान्य प्रदूषक और उनका प्रभाव
- प्रोटीन — 280 nm पर दृढ़ता से अवशोषित होता है (ट्रिप्टोफान, टायरोसिन, फेनिलएलनिन), A260/A280 अनुपात को 1.8 से नीचे लाता है।
- फेनोल — फेनोल-क्लोरोफॉर्म निष्कर्षण का एक अवशेष; यह 270–280 nm के पास अवशोषित होता है और 230 nm पर भी अवशोषित होता है, दोनों अनुपातों को कम करता है और स्पष्ट उपज को बढ़ाता है।
- गुआनिडीन / अराजक लवण और EDTA — 230 nm के चारों ओर अवशोषित होते हैं, मुख्य रूप से A260/A230 अनुपात को कम करते हैं जबकि A260/A280 सामान्य के करीब रहता है।
- DNA प्रस्तुति में RNA — A260/A280 अनुपात को ऊपर की ओर धकेलता है (2.0 की ओर) क्योंकि RNA इस अनुपात पर DNA की तुलना में अधिक पढ़ता है।
प्रयुक्त उदाहरण: एक स्पेक्ट्रोफोटोमीटर A260 = 0.452 और A280 = 0.251 की रिपोर्ट करता है। शुद्धता अनुपात 1.80 है, जो स्वच्छ द्वि-श्रृंखला DNA का संकेत देता है। ध्यान दें कि अनुपात केवल तभी अर्थपूर्ण है जब pH ~7.5–8.5 पर उचित बफर रिक्त के साथ रीडिंग ली जाती है, क्योंकि अम्लीय स्थितियां ~0.2–0.3 तक मान को कृत्रिम रूप से कम कर सकती हैं।
अक्सर पूछे जाने वाले सवाल
कौन-सा अनुपात शुद्ध DNA दर्शाता है? लगभग 1.8 का मान शुद्ध डबल-स्ट्रैंडेड DNA को दर्शाता है।
RNA के बारे में क्या? शुद्ध RNA में आमतौर पर लगभग 2.0 का अनुपात दिखता है।
क्या मुझे A260/A230 भी जाँचना चाहिए? हाँ — A260/A230 अनुपात (आदर्श रूप से 2.0–2.2) ग्वानिडीन या फीनॉल जैसे कार्बनिक संदूषकों को पहचानने में मदद करता है, जिन्हें A260/A280 अनुपात कभी-कभी पकड़ नहीं पाता।
