ما هي نسبة A260/A280؟
تُعد نسبة A260/A280 مقياسًا سريعًا بالمطياف الضوئي لتقدير نقاء الأحماض النووية. تمتص الأحماض النووية الضوء فوق البنفسجي بشدة عند طول موجي 260 نانومتر، في حين تمتص البروتينات عند 280 نانومتر بسبب الأحماض الأمينية العطرية مثل التربتوفان والتيروسين. وعند قسمة قيمة الامتصاص عند 260 نانومتر على قيمتها عند 280 نانومتر نحصل على نسبة تكشف مقدار البروتين أو الملوثات الأخرى الموجودة في مستحضر DNA أو RNA.
كيفية استخدام الحاسبة
اقرأ عينتك على مطياف ضوئي يعمل بالأشعة فوق البنفسجية (مثل جهاز NanoDrop) وسجّل قيمتي الامتصاص عند 260 نانومتر و280 نانومتر. أدخِل الرقمين في الأعلى لتعرض لك الحاسبة النسبة فورًا. واحرص على استخدام عينة مُعايَرة على فراغ (blank) ومخففة بشكل صحيح للحصول على قراءات دقيقة.
شرح المعادلة
المعادلة بسيطة: $$\text{Ratio} = \dfrac{A_{260}}{A_{280}}$$. ولأنها نسبة بين قيمتي امتصاص مقيستين على العينة نفسها، فإن طول المسار الضوئي والتركيز يُلغي بعضهما إلى حد كبير، مما يجعلها مؤشر جودة موثوقًا لا يتأثر بمدى تركيز العينة.
تفسير النتيجة
تُعتبر النسبة القريبة من 1.8 دليلًا على نقاء DNA، بينما تشير النسبة القريبة من 2.0 إلى نقاء RNA. أما النسبة المنخفضة بشكل ملحوظ (أقل من 1.7 مثلًا) فقد تدل على وجود بروتين أو فينول أو ملوثات أخرى تمتص بالقرب من 280 نانومتر. وقد تظهر نسبة أعلى من المتوقع عند تلوث عينة DNA ببقايا RNA.
مثال تطبيقي
لنفترض أن جهاز NanoDrop سجّل A260 = 1.8 وA280 = 1.0. عندها تكون النسبة $$\text{Ratio} = \dfrac{1.8}{1.0} = 1.8$$ وهو ما يشير إلى حمض نووي جينومي نقي يخلو تقريبًا من تلوث البروتين.
قيم مرجعية لنقاء A260/A280
تقارن نسبة A260/A280 بين الامتصاص عند 260 نانومتر (الحد الأقصى للامتصاص للأحماض النووية) والامتصاص عند 280 نانومتر (الحد الأقصى للامتصاص للأحماض الأمينية العطرية في البروتين). لأن الحمض النووي والحمض الريبوزي النووي النقيين لديهما نسب مميزة، فإن القيمة توفر فحصًا طيفيًا سريعًا لنظافة العينة. النسبة المكملة A260/A230 تكتشف فئة مختلفة من الملوثات (المركبات العضوية والأملاح الخاوترية)، لذلك يتم الإبلاغ عن الاثنين معًا عادة.
| العينة / الحالة | A260/A280 المتوقع | A260/A230 المتوقع | التفسير |
|---|---|---|---|
| الحمض النووي ثنائي الحبلة النقي (dsDNA) | ~1.8 | ~2.0–2.2 | الهدف المقبول للحمض النووي الجينومي/البلازميدي النظيف |
| الحمض الريبوزي النووي النقي | ~2.0 | ~2.0–2.2 | الهدف المقبول للحمض النووي الريبوزي الكلي/الرسول النظيف |
| الحمض النووي أحادي الحبلة النقي (ssDNA) / قلائح النيوكليوتيدات | ~1.9 | ~2.0–2.2 | يقع بين dsDNA والحمض النووي الريبوزي اعتمادًا على تكوين القاعدة |
| A260/A280 أقل من ~1.7 | < 1.7 | — | من المحتمل وجود بروتين أو فينول أو ممتصات 280 نانومتر أخرى |
| A260/A280 أكثر من ~2.0 (للحمض النووي) | > 2.0 | — | تسرب حمض الريبوزي النووي المحتمل أو النيوكليوتيدات المتحللة أو درجة الحموضة القلوية |
| A260/A230 منخفضة (على سبيل المثال < 1.8) | — | < 1.8 | أملاح الجوانيدين أو الفينول أو EDTA أو تلوث الكربوهيدرات |
الملوثات الشائعة وتأثيرها
- البروتين — يمتص بقوة عند 280 نانومتر (التريبتوفان والتيروسين والفنيل الأنين)، مما يقلل نسبة A260/A280 إلى أقل من 1.8.
- الفينول — بقايا استخراج الفينول-كلوروفورم؛ يمتص بالقرب من 270–280 نانومتر وأيضًا عند 230 نانومتر، مما يثبط كلا النسبتين ويضخم العائد الظاهري.
- الجوانيدين / الأملاح الخاوترية و EDTA — تمتص حول 230 نانومتر، وتخفض بشكل رئيسي نسبة A260/A230 بينما تترك A260/A280 أقرب إلى الطبيعي.
- الحمض الريبوزي النووي في تحضير الحمض النووي — يدفع نسبة A260/A280 نحو الأعلى (نحو 2.0) لأن الحمض الريبوزي النووي يقرأ أعلى من الحمض النووي عند هذه النسبة.
مثال مشروح: يبلغ مطياف الضوء عن A260 = 0.452 و A280 = 0.251. نسبة النقاء هي 1.80، مما يشير إلى حمض نووي ثنائي الحبلة نظيف. لاحظ أن النسبة ذات مغزى فقط عندما يتم أخذ القراءات عند درجة حموضة ~7.5–8.5 مع خط أساس مخزن مؤقت مناسب، لأن الظروف الحمضية يمكن أن تخفض القيمة بشكل مصطنع بمقدار يصل إلى ~0.2–0.3.
الأسئلة الشائعة
ما النسبة التي تدل على نقاء DNA؟ القيمة القريبة من 1.8 تشير إلى DNA ثنائي السلسلة نقي.
وماذا عن RNA؟ عادةً ما يُظهر RNA النقي نسبة تقارب 2.0.
هل ينبغي فحص نسبة A260/A230 أيضًا؟ نعم — تساعد نسبة A260/A230 (ويُفضّل أن تكون بين 2.0 و2.2) على كشف الملوثات العضوية مثل الغوانيدين أو الفينول التي قد لا تكشفها نسبة A260/A280.
