Tỷ lệ A260/A280 là gì?
Tỷ lệ A260/A280 là một phép đo nhanh bằng quang phổ để xác định độ tinh sạch của axit nucleic. Axit nucleic hấp thụ mạnh tia cực tím ở bước sóng 260 nm, trong khi protein (do chứa các axit amin thơm như tryptophan và tyrosine) lại hấp thụ ở 280 nm. Khi chia giá trị độ hấp thụ tại 260 nm cho giá trị tại 280 nm, ta thu được một tỷ lệ phản ánh mức độ protein hoặc các tạp chất khác có trong mẫu DNA hay RNA.
Cách sử dụng công cụ này
Hãy đo mẫu trên máy quang phổ UV (chẳng hạn như máy NanoDrop) và ghi lại các giá trị độ hấp thụ tại 260 nm và 280 nm. Nhập cả hai con số vào ô phía trên, công cụ sẽ trả về tỷ lệ ngay lập tức. Để có kết quả chính xác, bạn nên dùng mẫu đã được hiệu chỉnh nền (blank) và pha loãng đúng cách.
Giải thích công thức
Phép tính rất đơn giản: $$\text{Tỷ lệ} = \dfrac{A_{260}}{A_{280}}$$ Vì đây là tỷ lệ giữa hai giá trị độ hấp thụ đo trên cùng một mẫu, nên chiều dài đường truyền ánh sáng và nồng độ phần lớn triệt tiêu lẫn nhau. Nhờ vậy, đây là một chỉ số chất lượng đáng tin cậy, không phụ thuộc vào việc mẫu đặc hay loãng.
Cách đọc kết quả
Với DNA, tỷ lệ khoảng 1,8 thường được xem là "tinh sạch"; còn với RNA con số này là khoảng 2,0. Nếu tỷ lệ thấp hơn đáng kể (ví dụ dưới 1,7), mẫu có thể bị lẫn protein, phenol hoặc các tạp chất khác hấp thụ ở vùng gần 280 nm. Ngược lại, tỷ lệ cao hơn mức kỳ vọng có thể cho thấy mẫu DNA bị nhiễm RNA.
Ví dụ minh họa
Giả sử máy NanoDrop báo A260 = 1,8 và A280 = 1,0. Khi đó tỷ lệ là $$\dfrac{1{,}8}{1{,}0} = 1{,}8$$ cho thấy đây là mẫu DNA bộ gen sạch với rất ít protein lẫn vào.
Giá trị tham chiếu độ tinh khiết A260/A280
Tỉ số A260/A280 so sánh độ hấp thụ ở 260 nm (độ hấp thụ cực đại của axit nucleic) với độ hấp thụ ở 280 nm (độ hấp thụ cực đại của axit ơ-arom trong protein). Bởi vì DNA và RNA tinh khiết có tỉ số đặc trưng, giá trị này là phép kiểm tra quang phổ nhanh chóng về độ sạch của một mẫu. Tỉ số bổ sung A260/A230 phát hiện một loại tạp chất khác nhau (hợp chất hữu cơ và muối chaotropic), vì vậy hai tỉ số này thường được báo cáo cùng nhau.
| Mẫu / điều kiện | A260/A280 dự kiến | A260/A230 dự kiến | Diễn giải |
|---|---|---|---|
| DNA lưỡng chuỗi tinh khiết (dsDNA) | ~1.8 | ~2.0–2.2 | Mục tiêu được chấp nhận cho DNA bộ gen/plasmid sạch |
| RNA tinh khiết | ~2.0 | ~2.0–2.2 | Mục tiêu được chấp nhận cho RNA toàn bộ/messenger sạch |
| DNA một chuỗi tinh khiết (ssDNA) / oligonucleotide | ~1.9 | ~2.0–2.2 | Nằm giữa dsDNA và RNA tùy thuộc vào thành phần base |
| A260/A280 dưới ~1.7 | < 1.7 | — | Có thể có protein, phenol hoặc các chất hấp thụ khác ở 280 nm |
| A260/A280 trên ~2.0 (cho DNA) | > 2.0 | — | Có thể có RNA mang theo, nucleotide bị phân hủy hoặc pH kiềm |
| A260/A230 thấp (ví dụ < 1.8) | — | < 1.8 | Tạp chất muối guanidine, phenol, EDTA hoặc carbohydrate |
Các tạp chất phổ biến và ảnh hưởng của chúng
- Protein — hấp thụ mạnh ở 280 nm (tryptophan, tyrosine, phenylalanine), làm giảm tỉ số A260/A280 dưới 1.8.
- Phenol — dư lượng từ chiết xuất phenol-chloroform; nó hấp thụ gần 270–280 nm và cũng ở 230 nm, làm giảm cả hai tỉ số và làm tăng hiệu suất rõ ràng.
- Guanidine / muối chaotropic và EDTA — hấp thụ quanh 230 nm, chủ yếu làm giảm tỉ số A260/A230 trong khi giữ A260/A280 gần bình thường hơn.
- RNA trong chuẩn bị DNA — đẩy tỉ số A260/A280 hướng lên (hướng tới 2.0) vì RNA đọc cao hơn DNA ở tỉ số này.
Ví dụ thực tế: một quang phổ kế báo cáo A260 = 0.452 và A280 = 0.251. Tỉ số độ tinh khiết là 1.80, chỉ ra DNA lưỡng chuỗi sạch. Lưu ý rằng tỉ số chỉ có ý nghĩa khi các chỉ số được lấy ở pH ~7.5–8.5 với một lần trống buffer thích hợp, vì điều kiện axit có thể làm giảm giá trị một cách tự động lên tới ~0.2–0.3.
Câu hỏi thường gặp
Tỷ lệ bao nhiêu thì DNA được coi là tinh sạch? Giá trị quanh mức 1,8 cho thấy DNA mạch kép đã tinh sạch.
Còn với RNA thì sao? RNA tinh sạch thường có tỷ lệ vào khoảng 2,0.
Tôi có nên kiểm tra thêm tỷ lệ A260/A230 không? Có — tỷ lệ A260/A230 (lý tưởng là 2,0–2,2) giúp phát hiện các tạp chất hữu cơ như guanidine hay phenol mà tỷ lệ A260/A280 có thể bỏ sót.
