Что такое соотношение A260/A280?
Соотношение A260/A280 — это быстрый спектрофотометрический способ оценить чистоту нуклеиновых кислот. Нуклеиновые кислоты сильно поглощают ультрафиолет на длине волны 260 нм, а белки (за счёт ароматических аминокислот — триптофана и тирозина) поглощают на 280 нм. Разделив поглощение при 260 нм на поглощение при 280 нм, мы получаем показатель, который говорит о том, сколько белка или других примесей содержится в препарате ДНК или РНК.
Как пользоваться калькулятором
Измерьте образец на УФ-спектрофотометре (например, на NanoDrop) и запишите значения поглощения при 260 нм и 280 нм. Введите оба числа в поля выше — калькулятор сразу же выдаст соотношение. Для точных измерений используйте правильно разведённый образец и обязательно сделайте калибровку по бланку (нулевой пробе).
Формула расчёта
Расчёт предельно прост:
$$\text{Соотношение} = \dfrac{A_{260}}{A_{280}}$$Поскольку это отношение двух значений поглощения, измеренных на одном и том же образце, длина оптического пути и концентрация практически сокращаются. Благодаря этому показатель остаётся надёжным индикатором качества независимо от того, насколько концентрирован образец.
Как интерпретировать результат
Значение около 1,8 обычно считается признаком «чистой» ДНК, а около 2,0 — чистой РНК. Заметно более низкое соотношение (например, ниже 1,7) может указывать на присутствие белка, фенола или других примесей, поглощающих вблизи 280 нм. Завышенное соотношение нередко возникает при загрязнении препарата ДНК остатками РНК.
Разбор примера
Допустим, NanoDrop показал \(A_{260} = 1{,}8\) и \(A_{280} = 1{,}0\). Тогда соотношение равно
$$\text{Соотношение} = \dfrac{1{,}8}{1{,}0} = 1{,}8$$это говорит о чистой геномной ДНК практически без белковых примесей.
Частые вопросы
Какое соотношение означает чистую ДНК? Значение около 1,8 указывает на чистую двухцепочечную ДНК.
А что с РНК? Для чистой РНК соотношение обычно составляет примерно 2,0.
Нужно ли проверять ещё и A260/A230? Да. Соотношение A260/A230 (в идеале 2,0–2,2) помогает выявить органические примеси — например, гуанидин или фенол, — которые показатель A260/A280 может не уловить.
Справочные значения чистоты A260/A280
Отношение A260/A280 сравнивает поглощение при 260 нм (максимум поглощения нуклеиновых кислот) с поглощением при 280 нм (максимум поглощения ароматических аминокислот в белке). Поскольку очищенные ДНК и РНК имеют характерные отношения, это значение служит быстрой спектрофотометрической проверкой чистоты образца. Дополнительное отношение A260/A230 обнаруживает другой класс примесей (органические соединения и хаотропные соли), поэтому оба показателя обычно приводят вместе.
| Образец / условия | Ожидаемое A260/A280 | Ожидаемое A260/A230 | Интерпретация |
|---|---|---|---|
| Чистая двухцепочечная ДНК (дДНК) | ~1,8 | ~2,0–2,2 | Принятый стандарт для чистой геномной/плазмидной ДНК |
| Чистая РНК | ~2,0 | ~2,0–2,2 | Принятый стандарт для чистой суммарной/матричной РНК |
| Чистая однопроцепочечная ДНК (сДНК) / олигонуклеотиды | ~1,9 | ~2,0–2,2 | Находится между дДНК и РНК в зависимости от состава оснований |
| A260/A280 ниже ~1,7 | < 1,7 | — | Вероятно присутствие белка, фенола или других поглотителей при 280 нм |
| A260/A280 выше ~2,0 (для ДНК) | > 2,0 | — | Возможный остаток РНК, деградация нуклеотидов или щелочной pH |
| Низкое A260/A230 (например, < 1,8) | — | < 1,8 | Соли гуанидина, фенол, ЭДТА или загрязнение углеводами |
Распространённые примеси и их влияние
- Белок — сильно поглощает при 280 нм (триптофан, тирозин, фенилаланин), понижая отношение A260/A280 ниже 1,8.
- Фенол — остаток фенол-хлороформной экстракции; поглощает при 270–280 нм и также при 230 нм, снижая оба отношения и завышая кажущийся выход.
- Гуанидин / хаотропные соли и ЭДТА — поглощают около 230 нм, главным образом понижая отношение A260/A230, оставляя A260/A280 ближе к норме.
- РНК в препарате ДНК — повышает отношение A260/A280 (в сторону 2,0), потому что РНК показывает более высокое значение, чем ДНК при этом отношении.
Расчётный пример: спектрофотометр показывает A260 = 0,452 и A280 = 0,251. Коэффициент чистоты составляет 1,80, что указывает на чистую двухцепочечную ДНК. Обратите внимание, что это отношение имеет смысл только при снятии показаний при pH ~7,5–8,5 с надлежащим холостым раствором буфера, поскольку кислые условия могут искусственно понизить значение на ~0,2–0,3.
