Định luật Beer-Lambert là gì?
Định luật Beer-Lambert (còn gọi là định luật Beer) thể hiện mối liên hệ giữa độ hấp thụ ánh sáng của một dung dịch với các đặc tính của chính dung dịch đó. Theo định luật này, độ hấp thụ tỉ lệ thuận với độ hấp thụ mol của chất hấp thụ, nồng độ của dung dịch và chiều dài quãng đường mà ánh sáng đi qua mẫu. Công cụ này giải ngay phương trình \(A = \varepsilon \cdot c \cdot l\) và đồng thời cho biết độ truyền qua tương ứng.
Cách sử dụng máy tính
Bạn chỉ cần nhập ba giá trị: độ hấp thụ mol \(\varepsilon\) (đơn vị L·mol⁻¹·cm⁻¹, là hằng số đối với một chất nhất định tại một bước sóng nhất định), nồng độ \(c\) tính bằng mol/L, và chiều dài đường đi \(l\) tính bằng cm (thường là 1 cm đối với cuvet tiêu chuẩn). Máy tính sẽ nhân ba giá trị này để cho ra độ hấp thụ không có đơn vị (AU) và chuyển đổi thành độ truyền qua.
Giải thích công thức
Trong phương trình \(A = \varepsilon c l\), \(A\) là độ hấp thụ (không thứ nguyên), \(\varepsilon\) là độ hấp thụ mol (L·mol⁻¹·cm⁻¹), \(c\) là nồng độ mol (mol/L), và \(l\) là chiều dài đường đi (cm). Các đơn vị triệt tiêu lẫn nhau, để lại một con số thuần túy. Độ truyền qua được tính từ \(T = 10^{-A}\), còn phần trăm truyền qua là $$\%T = 100 \times 10^{-A}.$$ Độ hấp thụ càng cao thì lượng ánh sáng đi qua mẫu càng ít.
Ví dụ minh họa
Giả sử một loại thuốc nhuộm có \(\varepsilon = 20.000\) L·mol⁻¹·cm⁻¹, nồng độ 0,0001 mol/L (\(1 \times 10^{-4}\) M), được đo trong cuvet 1 cm. Khi đó $$A = 20.000 \times 0{,}0001 \times 1 = \mathbf{2{,}0}.$$ Độ truyền qua là \(T = 10^{-2} = 0{,}01\), tức 1% — nghĩa là chỉ 1% ánh sáng đi qua được mẫu.
Giá Trị Hấp Thụ Mol Điển Hình
Hấp thụ mol (còn gọi là hệ số tuyệt chủng mol, \(\varepsilon\)) là một thuộc tính nội tại của một chất ở bước sóng nhất định, được biểu thị bằng L·mol⁻¹·cm⁻¹. Vì \(\varepsilon\) thay đổi mạnh theo bước sóng, mỗi giá trị dưới đây được báo cáo ở bước sóng phân tích (cao nhất) nơi nó thường được đo lường. Sử dụng giá trị cho chính xác bộ đệm và bước sóng của xét nghiệm của bạn nếu có thể, vì \(\varepsilon\) có thể thay đổi theo dung môi, pH và nhiệt độ.
| Loài / chất nhuộm | Bước sóng (nm) | \(\varepsilon\) (L·mol⁻¹·cm⁻¹) |
|---|---|---|
| NADH (rút gọn) | 340 | 6,220 |
| NAD⁺ / NADH | 260 | ~18,000 |
| Kali permanganat (KMnO₄) | 525 | ~2,400 |
| Methylene blue | 665 | ~95,000 |
| Chlorophyll a (trong diethyl ether) | 662 | ~90,000 |
| Chlorophyll b (trong diethyl ether) | 644 | ~56,000 |
| Bromophenol blue (dạng cơ bản) | 590 | ~70,000 |
| Cytochrome c (rút gọn) | 550 | ~27,700 |
| FAD (oxy hóa) | 450 | ~11,300 |
| DNA hai sợi (mỗi nucleotide) | 260 | ~6,600 |
Các giá trị là những con số đại diện từ tài liệu và phụ thuộc vào dung môi và điều kiện; xác minh theo các tiêu chuẩn của riêng bạn cho công việc định lượng. Đối với công việc tinh sạch protein, tỷ lệ A260/A280 có liên quan sử dụng trực tiếp các độ hấp thụ UV này thay vì \(\varepsilon\).
Giải Thích Độ Hấp Thụ và Độ Truyền Qua Của Bạn
Độ hấp thụ \(A\) và độ truyền qua \(T\) mô tả cùng một phép đo trên các thang khác nhau, liên hệ bởi \(A = -\log_{10}(T)\) trong đó \(T\) là phần nhỏ của ánh sáng truyền qua (\(\%T = 100 \times T\)). Độ hấp thụ là logarit, vì vậy mỗi lần tăng đơn vị có nghĩa là mười lần ít ánh sáng hơn đến bộ detektor.
- A ≈ 0 — mẫu về cơ bản là trong suốt ở bước sóng này và truyền qua khoảng 0 đơn vị hấp thụ (≈100 %T). Ít hoặc không phát hiện được chất phân tích.
- A = 1 — chỉ 10 %T; 90% ánh sáng bị hấp thụ.
- A = 2 — chỉ 1 %T; 99% ánh sáng bị hấp thụ. Bộ detektor hiện chỉ nhìn thấy rất ít tín hiệu.
Hầu hết các máy quang phổ kế cho kết quả chính xác và tuyến tính nhất trong phạm vi khoảng A = 0,1 đến 1,0. Dưới khoảng 0,1 tín hiệu nhỏ so với nhiễu cơ bản; trên khoảng 1,0 ánh sáng lạc và hạn chế bộ detektor làm cho mối quan hệ Beer-Lambert lệch khỏi tuyến tính, vì vậy nồng độ biểu kiến đọc thấp.
Nếu lần đọc của bạn vượt quá khoảng 1,0, hãy pha loãng mẫu (ví dụ 1:2 hoặc 1:10), đo lại và nhân kết quả với hệ số pha loãng. Điều này giữ phép đo trong vùng tuyến tính nơi \(A = \varepsilon c l\) giữ độ tin cậy. Bạn có thể lên kế hoạch pha loãng như vậy với một máy tính pha loãng dung dịch C1V1 = C2V2.
Độ Hấp Thụ Trong Các Đầu Vào Khác Nhau
Bảng dưới đây sửa hấp thụ mol tại \(\varepsilon = 10{,}000\) L·mol⁻¹·cm⁻¹ và thay đổi nồng độ \(c\) và chiều dài đường đi \(l\). Độ hấp thụ tỷ lệ tuyến tính với cả hai, trong khi độ truyền qua tuân theo \(\%T = 100 \times 10^{-A}\). Chú ý cách nồng độ cao hơn hoặc cuvet dài hơn đẩy \(A\) ra ngoài cửa sổ 0,1–1,0 đáng tin cậy.
| \(\varepsilon\) (L·mol⁻¹·cm⁻¹) | \(c\) (M) | \(l\) (cm) | \(A = \varepsilon c l\) | %T |
|---|---|---|---|---|
| 10,000 | 1×10⁻⁵ | 1 | 0,10 | 79,4% |
| 10,000 | 5×10⁻⁵ | 1 | 0,50 | 31,6% |
| 10,000 | 1×10⁻⁴ | 1 | 1,00 | 10,0% |
| 10,000 | 1×10⁻⁴ | 0,5 | 0,50 | 31,6% |
| 10,000 | 1×10⁻⁴ | 2 | 2,00 | 1,0% |
Hai hàng cuối cùng so sánh chiều dài đường đi cho cùng một dung dịch: giảm cuvet xuống 0,5 cm giảm \(A\) vào phạm vi lý tưởng, trong khi ô 2 cm tăng gấp đôi nó lên 2,00 — bên ngoài vùng tuyến tính, nơi pha loãng sẽ là cách sửa tốt hơn. Để tìm nồng độ tạo ra độ hấp thụ được đo, đảo ngược phép tính bằng máy tính nồng độ từ độ hấp thụ (Định luật Beer-Lambert).
Câu hỏi thường gặp
Chiều dài đường đi thông thường là bao nhiêu? Các cuvet tiêu chuẩn dùng trong máy quang phổ có chiều dài đường đi 1 cm, nên định luật thường được rút gọn thành \(A = \varepsilon c\).
Tại sao định luật không còn đúng ở nồng độ cao? Ở nồng độ cao, các phân tử tương tác với nhau, đồng thời ánh sáng lạc hoặc giới hạn của thiết bị gây ra sai lệch khỏi tính tuyến tính. Vì vậy, định luật Beer chính xác nhất với các dung dịch loãng (thường là \(A < 1\)).
Tôi có thể tính nồng độ thay vì độ hấp thụ không? Có — chỉ cần biến đổi thành \(c = A / (\varepsilon l)\). Nếu biết độ hấp thụ và các hằng số, bạn chỉ việc chia tương ứng.
