Protein Konsantrasyonu Hesaplama Aracı

Hesaplamaya Girin

280 nm'de Absorbans (A280)

Ekstinksiyon Katsayısı (mL·mg⁻¹·cm⁻¹)

Işık Yolu Uzunluğu (cm)

Sonuç

Protein Konsantrasyonu

0,714

mg/mL

Konsantrasyon (µg/mL)	714,29

Protein Konsantrasyonu Hesaplama Aracı Nedir?

Bu araç, bir protein çözeltisinin konsantrasyonunu UV spektrofotometrede 280 nm dalga boyunda ölçülen absorbans (A280) değerinden tahmin eder. Aromatik amino asit kalıntıları — triptofan, tirozin ve az miktarda sistein — 280 nm'de ışığı emer; bu nedenle absorbans, protein konsantrasyonuyla doğru orantılıdır. Beer-Lambert yasasını kullanarak ve proteinin kütle ekstinksiyon katsayısını bildiğinizde, okuma değerini mililitre başına miligrama (mg/mL) çevirebilirsiniz.

Nasıl Kullanılır?

Üç değer girin: ölçülen absorbans (A280), kütle ekstinksiyon katsayısı \(\varepsilon\) (mL·mg⁻¹·cm⁻¹ cinsinden) ve küvet ışık yolu uzunluğu (genellikle 1 cm). \(\varepsilon\) için sıkça kullanılan genel bir değer, "1 mg/mL = 1 AU" varsayımına dayalı 1,0'dır; IgG için ise genellikle ~1,4 alınır. Araç, konsantrasyonu mg/mL ve µg/mL olarak verir.

Formülün Açıklaması

Beer-Lambert yasası \(A = \varepsilon \times C \times l\) şeklinde ifade edilir; burada \(A\) absorbans, \(\varepsilon\) ekstinksiyon katsayısı, \(C\) konsantrasyon ve \(l\) ışık yolu uzunluğudur. Denklemi konsantrasyon için düzenlediğimizde

$$C = \dfrac{A_{280}}{\varepsilon \times l}$$

elde edilir. Işık yolu 1 cm olduğunda bu formül \(C = A_{280} / \varepsilon\) haline gelir.

Beer-Lambert yasası: absorbans; konsantrasyon, yol uzunluğu (l) ve sönüm katsayısı (ε) ile ilişkilidir.

Örnek Hesaplama

Diyelim ki 1 cm'lik bir küvette \(\varepsilon = 1{,}4\) mL·mg⁻¹·cm⁻¹ olan bir antikor için A280 = 0,700 ölçtünüz. Bu durumda

$$C = \dfrac{0{,}700}{1{,}4 \times 1} = 0{,}5 \text{ mg/mL}$$

yani 500 µg/mL olur.

Spektrofotometre A280 absorbansını okur ve bu değer formüle yerleştirilir.

Sıkça Sorulan Sorular

Hangi ekstinksiyon katsayısını kullanmalıyım? Proteinize özgü kütle katsayısını kullanın (genellikle ProtParam veya tedarikçi veri sayfasından alınır). 1,0 kaba bir varsayılan değerdir; 1,4 ise IgG için tipiktir.

Neden 280 nm'de ölçüm yapılır? Aromatik amino asitler 280 nm'de güçlü şekilde absorbans gösterir; bu da onu işaretsiz (label-free) protein miktar tayini için standart dalga boyu yapar.

Işık yolu uzunluğu önemli mi? Evet — çoğu küvet 1 cm'dir, ancak mikro-hacim cihazları (örneğin NanoDrop) daha kısa ışık yolları kullanır ve bu değerin doğru girilmesi gerekir.