प्रोटीन सांद्रता कैलकुलेटर क्या है?
यह कैलकुलेटर UV स्पेक्ट्रोफोटोमीटर पर 280 nm (A280) पर मापे गए अवशोषण के आधार पर प्रोटीन घोल की सांद्रता का अनुमान लगाता है। एरोमैटिक अवशेष — ट्रिप्टोफैन, टायरोसिन और थोड़ी मात्रा में सिस्टीन — 280 nm पर प्रकाश को अवशोषित करते हैं, इसलिए अवशोषण सीधे प्रोटीन सांद्रता के समानुपाती होता है। बीयर-लैम्बर्ट नियम का उपयोग करके, यदि आपको प्रोटीन का मास एक्सटिंक्शन गुणांक पता हो, तो आप रीडिंग को मिलीग्राम प्रति मिलीलीटर (mg/mL) में बदल सकते हैं।
इसका उपयोग कैसे करें
तीन मान दर्ज करें: मापा गया अवशोषण (A280), मास एक्सटिंक्शन गुणांक \(\varepsilon\) (mL·mg⁻¹·cm⁻¹ में), और क्यूवेट का पथ-लंबाई (आमतौर पर 1 cm)। \(\varepsilon\) का एक सामान्य प्रचलित मान 1.0 होता है, जो "1 mg/mL = 1 AU" की धारणा पर आधारित है, जबकि IgG के लिए इसे प्रायः ~1.4 लिया जाता है। कैलकुलेटर सांद्रता को mg/mL और µg/mL दोनों में दिखाता है।
सूत्र की व्याख्या
बीयर-लैम्बर्ट नियम कहता है कि \(A = \varepsilon \times C \times l\), जहाँ \(A\) अवशोषण है, \(\varepsilon\) एक्सटिंक्शन गुणांक है, \(C\) सांद्रता है, और \(l\) पथ-लंबाई है। सांद्रता के लिए इसे फिर से व्यवस्थित करने पर मिलता है $$C = \dfrac{A_{280}}{\varepsilon \times l}$$ जब पथ-लंबाई 1 cm हो, तो यह सरल होकर बन जाता है \(C = A_{280} / \varepsilon\)।
हल किया हुआ उदाहरण
मान लीजिए आप एक एंटीबॉडी के लिए \(A_{280} = 0.700\) मापते हैं, जिसका \(\varepsilon = 1.4\) mL·mg⁻¹·cm⁻¹ है और जो 1 cm की क्यूवेट में है। तब $$C = \frac{0.700}{1.4 \times 1} = 0.5 \text{ mg/mL}$$ यानी 500 µg/mL।
अक्सर पूछे जाने वाले प्रश्न
मुझे कौन-सा एक्सटिंक्शन गुणांक इस्तेमाल करना चाहिए? अपने प्रोटीन के लिए विशिष्ट मास गुणांक का उपयोग करें (जो अक्सर ProtParam या आपूर्तिकर्ता की डेटाशीट से मिलता है)। 1.0 एक मोटा-मोटा डिफ़ॉल्ट है; IgG के लिए 1.4 सामान्य है।
280 nm पर ही माप क्यों लेते हैं? एरोमैटिक अमीनो अम्ल 280 nm पर तीव्रता से अवशोषण करते हैं, इसी कारण यह लेबल-रहित प्रोटीन मात्रन के लिए मानक तरंगदैर्ध्य है।
क्या पथ-लंबाई मायने रखती है? हाँ — अधिकांश क्यूवेट 1 cm की होती हैं, लेकिन माइक्रो-वॉल्यूम उपकरण (जैसे NanoDrop) छोटी पथ-लंबाई का उपयोग करते हैं, जिसे सही-सही दर्ज करना ज़रूरी है।
