Ligasyon Hesaplayıcı nedir?
Ligasyon Hesaplayıcı, insert ve vektörün seçtiğiniz bir molar oranda bulunmasını sağlayacak şekilde bir ligasyon reaksiyonu kurmak için ne kadar insert DNA'ya ihtiyacınız olduğunu hesaplar. Daha uzun DNA fragmanları molekül başına daha ağır olduğundan, insert ve vektörü basitçe eşit miktarlarda karıştıramazsınız; insert miktarını fragman uzunluklarının oranına ve istediğiniz molar orana göre ölçeklendirmeniz gerekir. Bu araç evrenseldir ve laboratuvar ya da ülke fark etmeksizin standart moleküler klonlama için geçerlidir.
Nasıl kullanılır?
Kullanmayı planladığınız vektör miktarını (nanogram cinsinden), vektörün baz çifti (bp) cinsinden uzunluğunu, insert'inizin bp cinsinden uzunluğunu ve istediğiniz insert:vektör molar oranını girin (yapışkan uçlu ligasyonlar için 3:1 insert-vektör oranı yaygın bir başlangıç noktasıdır). Hesaplayıcı, vektörle birleştirmeniz gereken insert miktarını ng cinsinden verir.
Formülün açıklaması
Gereken insert miktarı şu şekilde bulunur:
$$\text{insert miktarı} = \frac{\text{oran} \times \text{insert uzunluğu} \times \text{vektör miktarı}}{\text{vektör uzunluğu}}$$
(insert uzunluğu / vektör uzunluğu) kesri, 1:1 kütle oranını 1:1 molar orana çevirir; istediğiniz molar oranla çarpmak ise bunu hedefinize göre ölçeklendirir. Sonuç, vektör miktarıyla aynı kütle biriminde (ng) ifade edilir.
Örnek hesaplama
Diyelim ki 5000 bp'lik bir vektörden 50 ng kullanıyorsunuz ve 1000 bp'lik bir insert ile 3:1 molar oran istiyorsunuz. Bu durumda $$\text{insert miktarı} = \frac{3 \times 1000 \times 50}{5000} = \frac{150000}{5000} = 30 \text{ ng}$$ olur. Yani reaksiyona 30 ng insert eklersiniz.
Sıkça Sorulan Sorular
Hangi molar oranı kullanmalıyım? Yapışkan uçlu ligasyonlar için 3:1 insert:vektör oranı tipiktir; 1:1'den 5:1'e kadar (kör uçlar için daha yüksek) oranlar yaygındır. Klonlama zorsa birkaç farklı oranı deneyin.
Sonuç ng cinsinden mi? Evet. Insert miktarı, vektör miktarı için kullandığınız birimle aynı şekilde, yani burada nanogram cinsinden verilir.
Uzunluğa vektör omurgası dahil mi? Her bir doğrusallaştırılmış molekülün baz çifti cinsinden tam uzunluğunu kullanın; vektör için omurga dahil, insert için ise fragmanın tamamı dahil olacak şekilde.
