PCR Master Mix Hesaplama Aracı nedir?
PCR master mix hesaplama aracı, bir grup polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tüpü hazırlamak için her reaktiften ne kadar gerektiğini hesaplar. Her bileşeni tek tek her tüpe pipetlemek yerine, ortak tek bir master mix hazırlayıp bunu tüplere paylaştırırsınız. Bu araç, her reaktifi reaksiyon sayısına ve bir pipetleme fazlasına göre ölçeklendirir; böylece karışım hiçbir zaman yetersiz kalmaz.
Nasıl kullanılır?
Tek reaksiyon hacmini, reaksiyon sayısını ve bir pipetleme fazlasını (genellikle %5–10) girin. Her reaktif için stok konsantrasyonunu ve reaksiyonda hedeflenen son konsantrasyonu yazın. Hesaplayıcı, her reaktifin hacmini, kalıp (template) hacmini ve geri kalanı dengeleyen nükleaz içermeyen su hacmini verir.
Formülün açıklaması
Her reaktif hacmi, seyreltme bağıntısı \(C_1 V_1 = C_2 V_2\)'den gelir. Master mix için bunu etkin reaksiyon sayısı \(n = \text{reaksiyon} \times (1 + \text{fazla}/100)\) ile çarparız:
$$V = \frac{C_{\text{son}} \times V_{\text{reaksiyon}} \times n}{C_{\text{stok}}}$$Her bileşen için stok ve son konsantrasyon birimleri birbiriyle tutarlı olmalıdır (X ile X, mM ile mM, µM ile µM, U/µL ile U/µL).
Örnek hesaplama
%10 fazlayla, her biri 25 µL olan 10 reaksiyon için \(n = 10 \times 1{,}10 = 11\). 10X tamponu 1X'e getirmek için
$$\frac{1 \times 25 \times 11}{10} = 27{,}5 \ \mu\text{L}$$gerekir. dNTP'leri 10 mM'den 0,2 mM'ye seyreltmek için
$$\frac{0{,}2 \times 25 \times 11}{10} = 5{,}5 \ \mu\text{L}$$gerekir. Toplam karışım hacmi \(25 \times 11 = 275 \ \mu\text{L}\) olup, su tüm reaktifler ve kalıptan sonra kalan boşluğu doldurur.
Sıkça Sorulan Sorular
Neden pipetleme fazlası ekleriz? Pipet uçlarında ve tüp duvarlarında oluşan küçük hacim kayıpları zamanla birikir; %5–10 fazla, son tüpün de tam reaksiyon almasını sağlar.
Su negatif çıkarsa ne yapmalı? Reaktif hacimleriniz reaksiyon hacmini zaten aşmıştır — bir son konsantrasyonu düşürün, bir stoğu yükseltin ya da reaksiyon hacmini artırın.
Bir bileşeni boş bırakabilir miyim? Stoğunu 0 olarak ayarlayarak onu hariç tutabilirsiniz; o reaktifin hacmi 0 olur ve farkı su tamamlar.
