ما هي حاسبة الخليط الرئيسي لتفاعل PCR؟
تحسب حاسبة الخليط الرئيسي (Master Mix) كمية كل كاشف تحتاجها لتحضير دفعة من أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). فبدلاً من سحب كل مكوّن على حدة إلى داخل كل أنبوب، تُحضّر خليطًا رئيسيًا مشتركًا واحدًا ثم توزّعه على الأنابيب. تضرب هذه الأداة حجم كل كاشف في عدد التفاعلات مضافًا إليه فائض السحب، حتى لا ينفد منك الخليط قبل ملء الأنبوب الأخير.
طريقة الاستخدام
أدخل حجم التفاعل الواحد، وعدد التفاعلات، ونسبة فائض السحب (عادةً بين 5 و10%). ثم لكل كاشف، أدخل التركيز الأصلي (Stock) والتركيز النهائي المطلوب داخل التفاعل. تعرض لك الحاسبة حجم كل كاشف، وحجم القالب (Template)، وحجم الماء الخالي من النيوكلياز الذي يكمل الموازنة.
شرح المعادلة
يُحسب حجم كل كاشف اعتمادًا على علاقة التخفيف \(C_1 V_1 = C_2 V_2\). وعند تحضير الخليط الرئيسي نضرب في عدد التفاعلات الفعلي \(n = \text{عدد التفاعلات} \times \left(1 + \frac{\text{الفائض}}{100}\right)\):
$$V = \frac{C_{\text{النهائي}} \times V_{\text{التفاعل}} \times n}{C_{\text{الأصلي}}}$$ويجب أن تكون الوحدات متطابقة بين التركيز الأصلي والنهائي لكل مكوّن (X مع X، وmM مع mM، وµM مع µM، وU/µL مع U/µL).
مثال تطبيقي
لـ 10 تفاعلات بحجم 25 ميكرولتر لكل منها مع فائض 10%، يكون \(n = 10 \times 1.10 = 11\). يحتاج محلول منظم بتركيز 10X لتخفيفه إلى 1X إلى
$$\frac{1 \times 25 \times 11}{10} = 27.5 \text{ ميكرولتر}$$وتحتاج النيوكليوتيدات (dNTPs) من 10 mM إلى 0.2 mM إلى
$$\frac{0.2 \times 25 \times 11}{10} = 5.5 \text{ ميكرولتر}$$أما حجم الخليط الإجمالي فهو \(25 \times 11 = 275\) ميكرولتر، ويملأ الماء ما تبقّى بعد إضافة جميع الكواشف والقالب.
الأسئلة الشائعة
لماذا نضيف فائض السحب؟ تتراكم الفواقد الصغيرة على أطراف الماصات وجدران الأنابيب؛ وإضافة 5 إلى 10% تضمن أن يحصل الأنبوب الأخير على تفاعل كامل.
ماذا لو خرجت قيمة الماء سالبة؟ هذا يعني أن أحجام الكواشف تجاوزت حجم التفاعل أصلاً — خفّض أحد التراكيز النهائية، أو ارفع تركيزًا أصليًا، أو زِد حجم التفاعل.
هل يمكنني ترك مكوّن فارغًا؟ اضبط تركيزه الأصلي على 0 لاستبعاده؛ عندها يصبح حجم ذلك الكاشف صفرًا ويعوّض الماء عنه.
