Công cụ tính nồng độ RNA là gì?
Công cụ này ước tính nồng độ của mẫu RNA dựa trên độ hấp thụ ánh sáng ở bước sóng 260 nm (A260) đo được trên máy quang phổ UV, chẳng hạn như NanoDrop. Công cụ sử dụng hệ số chuyển đổi tiêu chuẩn dựa trên hệ số tắt (extinction) dành cho RNA mạch đơn, theo đó giá trị A260 bằng 1,0 tương ứng với khoảng 40 ng/µL RNA. Đây là công thức chung, áp dụng được cho mọi phòng thí nghiệm trên toàn thế giới.
Cách sử dụng
Nhập giá trị A260 đo được, hệ số pha loãng đã dùng trước khi đo (nhập 1 nếu mẫu được đo trực tiếp không pha loãng), và nếu muốn tính tổng lượng RNA thu được thì nhập thêm thể tích mẫu tính bằng microlit. Công cụ sẽ trả về nồng độ theo ng/µL (tương đương µg/mL) cùng tổng lượng RNA thu hồi được.
Giải thích công thức
Nồng độ RNA (ng/µL):
$$\text{Concentration} = \text{A260} \times 40 \times \text{Dilution} \;\;\text{(ng/}\mu\text{L)}$$Hệ số 40 chính là hệ số tắt được xác định bằng thực nghiệm cho RNA mạch đơn ở bước sóng 260 nm trong cuvet có chiều dài đường quang 1 cm. Tổng lượng thu được (µg):
$$\text{Yield (}\mu\text{g)} = \frac{\left(\text{A260} \times 40 \times \text{Dilution}\right) \times \text{Volume }(\mu\text{L})}{1000}$$
Ví dụ minh họa
Giả sử A260 = 0,25, hệ số pha loãng = 50 và thể tích = 100 µL. Nồng độ:
$$0{,}25 \times 40 \times 50 = 500 \;\text{ng/}\mu\text{L}$$Tổng lượng thu được:
$$\frac{500 \times 100}{1000} = 50 \;\mu\text{g RNA}$$
Câu hỏi thường gặp
Vì sao là 40 mà không phải 50? Hệ số 50 được dùng cho DNA mạch kép; còn RNA mạch đơn hấp thụ ánh sáng hơi khác, nên hằng số được công nhận là 40 ng/µL cho mỗi đơn vị A260.
Còn độ tinh sạch thì sao? Riêng giá trị A260 chỉ cho biết nồng độ; bạn nên kiểm tra thêm tỷ lệ A260/A280 (khoảng 2,0 đối với RNA tinh sạch) và tỷ lệ A260/A230 để đánh giá mức độ tạp nhiễm.
Chiều dài đường quang có ảnh hưởng không? Hệ số này được tính dựa trên chiều dài đường quang chuẩn 1 cm. Các máy đo thể tích siêu nhỏ hiện đại sẽ tự động quy đổi kết quả về mức 1 cm.